Дефекты ферментов и их роль в изучении Синдром Леша-Найхана [1293]. В 1964 г. механизмов действия генов. Некоторые Леш и Найхан описали специфический дефекты ферментов сыграли заметную синдром [П98], характеризующийсяатетозом, гиперрефлексией и непременным самодеструктивным поведением, которое может выражаться даже в откусывании губ и пальцев [1164]. У всех пациентов (болеют только мальчики) наблюдается гиперурикемия и повышенная концентрация мочевой кислоты в моче, что приводит к образованию камней в почках и закупорке мочевых путей. Признак сцеплен с полом (разд. 3.1.4). Гетерозиготы клинически здоровы, однако поддаются выявлению.
В 1967 г. Сигмиллер и др. [1295] при обследовании больных с синдромом Леша - Найхана обнаружили практически полную недостаточность одного из фер-ментов метаболизма пуринов-гипо-ксантин-гуанин—фосфорибозилтрансферазы (HPRT) (у трех больных-в лизатах эритроцитов, у одного больного-в культуре фибробластов). Впоследствии дефект фермента был выявлен во многих тканях: печени, лейкоцитах и в мозге. Инозин-5-монофосфат образуется в нескольких реакциях, принадлежащих к разным метаболическим путям. Однако клетки могут использовать также готовые пури-новые основания и нуклеозиды, образующиеся при расщеплении нуклеиновых кислот. В этом пути «использования вторичного сырья» свободные пуриновые основания превращаются в соответствующие 5-мононуклеотиды. Имеются два фер-мента, один специфичен для гипоксантина, второй для аденина (рис. 4.21). Если первый фермент дефектен, то вторичного использования гипоксантина и гуанина не происходит, вместо этого они превращаются в мочевую кислоту. В результате развивается гиперурикемия с образованием камней в почках; однако остается неясным, чем обусловлены симптомы со стороны ЦНС. Дефекты HPRT удобно изучать в культуре фибробластов, вот почему этот фермент использовали в качестве модели при решении ряда проблем.

Гетерогенность на молекулярном уровне. В разных семьях обычно встречаются раз-личные мутации. Об этом свидетельствуют результаты изучения таких характеристик фермента, как остаточная активность, константа Михаэлиса—Ментен, термолабильность, ингибирование конечными продуктами - GMP и IMP и других. Иногда выраженная недостаточность HPRT имела место и в отсутствие признаков синдрома Леша-Найхана. Дефектная гипоксантин-гуанин—фосфорибозилтрансфераза была выявлена у некоторых взрослых больных подагрой [1162; 1294]. Однако подавляющее большинство людей, страдающих этим заболеванием, обладают нормальной HPRT. У тех немногих больных подагрой, которые имеют дефектный фермент, этот признак наследуется сцепленно с Х-хромо-сомой. Это еще раз указывает, что мутации действительно затрагивают один и тот же локус.

Доказательства инактивации Х-хромо-сомы. Одно из наиболее убедительных доказательств гипотезы Лайон (разд. 2.2.3.3) было получено при изучении активности фермента на уровне отдельных клеток у гетерозигот с мутациями по HPRT [1164]. Более того, эти исследования позволили по-новому взглянуть на метаболические взаимоотношения между клетками.

Метаболическая кооперация. Изучение культуры фибробластов кожи дает воз-можность идентифицировать гетеро-зиготных носителей мутации Если получить клоны из отдельных фиброблас-тов и определить активность фермента, измерив с помощью радиоавтографии количество поглощаемого клетками гипо-ксантина, меченного тритием, то оказыва-ется, что примерно у половины клонов активность HPRT нормальная, а у поло-вины фермент дефектен. Однако в культу-рах фибробластов, которые получены без клонирования, подавляющее большинство гетерозиготных клеток обладали активностью. Очевидно, при контакте клеток, дефектных по HPRT, с нормальными клетками их метаболический дефект подвергается коррекции [1090]. Этот вывод под-тверждается опытами, в которых нормаль-ные и дефектные клетки смешивали в одной культуре. Феномен назвали «метаболической кооперацией».

Рассмотрим три возможных механизма такой кооперации (рис. 4.22).
1 Нормальные клетки снабжают де-фектные клетки ДНК или мРНК, в резуль-тате последние приобретают способность синтезировать функционально активный фермент
2 Дефектные клетки получают от нор-мальных готовый фермент. В основе этого предположения аналогия с коррекцией дефектов при мукополисахаридозах (разд. 4 2 2 3). Инкубация культуры фиброблас-тов, дефектных по HPRT, с нормальными клетками, разрушенными ультразвуком, приводила к частичному восстановлению функции фермента.
3. Нормальные клетки синтезируют нуклеотид (конечный продукт), который переносится в дефектные клетки Большин-ство экспериментальных данных свидетель-ствует в пользу этого механизма. Если дефектные фибробласты отделить от нор-мальных клеток, их мутантный фенотип быстро восстанавливается, несмотря на то что нормальная гипоксантин-гуанин—фос-форибозилтрансфераза стабильна в этих условиях в течение многих часов. В другом эксперименте лимфоциты нормальной женщины инкубировали в среде, содержащей меченный тритием гипоксантин. Затем та-кие клетки смешивали в обычной среде с лимфоцитами мужчины, страдающего син-дромом Леша—Найхана. Спустя некоторое время Y-хромосомы мужских клеток с дефектным ферментом, окрашивали акрихинипритом, после чего проводили ра-диоавтографию. В мужских клетках об-наруживалась метка, что указывало на перенос нуклеотидов из нормальных клеток в дефектные В подобных опытах метабо-лическая кооперация была продемонстри-рована также между преинкубированны-ми нормальными эритроцитами и мутант-ными лимфоцитами или фибробластами. Оказалось, что в дефектные клетки перено-сится инозимонофосфат или одно из его производных; по-видимому, активную роль в этом процессе играет мембрана клетки [1053].

Другие проблемы, связанные с недостаточ-ностью HPRT. Дефектная HPRT стала важной модельной системой для изучения мутационного процесса. 1. Эта система дает возможность идентифицировать гемизигот и гетерозигот, измеряя активность фермента в фибро-бластах, и таким образом сравнивать частоты спонтанных мутаций у мужчин и женщин (разд. 5.15). 2 Ген HPRT экспрессируется в клетках амниотической жидкости, поэтому недостаточность гипоксантин-гуанин—фос-форибозилтрансферазы удается диагностировать с помощью амниоцентеза. Этим дефект HPRT в корне отличается от других патологических состояний, наследуемых сцепленно с Х-хромосо-мой, например гемофилии или мышечной дистрофии Дюшенна, при которых биохимический дефект не проявляется в клетках амниотической жидкости. 3. Разработана система отбора точковых мутаций в культурах фибробластов, основанная на использовании необычного субстрата, 8-азагуанина. Она позволяет изучать на клеточном уровне возникновение спонтанных и индуцированных мутаций. В нормальных клетках 8-азагуанин утилизируется HPRT, что приводит к гибели клеток. Клетки, дефектные по HPRT, не способны метабо-лизировать это соединение и выживают.

Иммунная недостаточность, связанная с дефек-тами аденозиндезаминазы и нуклеозидфосфорила-зы (рис 4 21) Дефект другого фермента, участвующего в метаболизме нуклеозидов, приводит к иному фенотипу. Этот случай тем более интересен, что дефектной является редкая форма полиморфного фермента. Дефекты одного или нескольких компонентов иммунной системы могут обусловливать повышенную восприимчивость к бактериальным инфекциям. Классическим примером такой патологии является гипогаммаглобулинемия, которая наследуется сцепленно с полом и обусловлена дефектом созревания В-лимфоцитов [1092; 1261]. В-лимфоциты служат местом образования гуморальных антител, и их отсутствие приводит к нарушению синтеза у-глобулинов. Т-лимфоциты обеспечивают клеточный иммунитет и при этом заболевании остаются интактными.
Различают несколько форм иммунной не-достаточности. Одна из них, называемая острой комбинированной обусловливает повышенную восприимчивость к заражению самыми разнооб-разными бактериями, вирусами и грибами. При этой форме нарушены функции как В-, так и Т-лимфоцитов. Иногда оказываются дефектными только Т-лимфоциты. Оказалось, что в основе таких дефектов лежит нарушение диф-ференцировки стволовых клеток в зрелые лим-фоидные клетки [1274; 1267]. Эта группа заболеваний гетерогенна по этиологии, поскольку известны как случаи с аутосомно-рецессивным наследованием, так и варианты, которые наследуются сцепленно с Х-хромосомой. Среди вариантов с аутосомно-рецессивным наследованием обнаружена дополнительная гетерогенность. Так, комбинированная иммунная недостаточность может быть вызвана дефектом аденозиндезаминазы (24275) или нуклеозидфосфори-лазы (16405) [1294].

Аденозиндезаминаза (ADA) катализирует необратимое дезаминирование и гидролиз адено-зина до инозина и иона аммония. Нуклеозид-фосфорилаза катализирует превращение инозина в гипоксантин и гуанозина в гуанин. Она обладает также небольшой активностью, обеспечи-вающей превращение аденозина в аденин. Эти ферменты играют ключевую роль в метаболизме РНК и ДНК.

Аденозиндезаминаза кодируется геном, ло-кализованным в 20-й хромосоме (разд. 3.4). Электрофорез в крахмальном геле продемон-стрировал полиморфизм этого фермента. Наиболее распространенный аллель обозначается ADA1, часто встречающийся полиморфный вариант ADA2. В западных популяциях аллель ADA2 встречается с частотой около 0,05 [1309]. Описаны и другие варианты ADA [1294]. Недостаточность ADA является аутосомно-рецессивным признаком. У больных детей в эритроцитах и других тканях активность аденозиндезаминазы полностью отсутствует [1098]. У их родителей, как правило, обнаруживаются промежуточные количества фермента, при этом клинически они вполне нормальны. У больных родителей выявляется остаточная активность ADA [1294]. Оказалось, что дефекты обусловлены структурными мутациями в гене ADA, которые приводят к почти полной потере функциональной активности фермента у больных гомозигот. Разработана пренатальная диагностика недостаточности аденозиндезаминазы [1126].

Нуклеозидфосфорилаза кодируется локусом в 14-й хромосоме [1096]. Обнаружено несколько редких вариантов фермента [1064]. У больных активность нуклеозидфосфорилазы полностью отсутствует, у родителей активность фермента промежуточная [1294]; заболевание наследуется по аутосомно-рецессивному типу. Иммунологическими методами показано, что по меньшей мере две мутации вызывают недостаточность нуклеозидфосфорилазы [1256]. При одной из них имеется перекрестно реагирующий материал (ПРМ), при другой его нет (см. разд. 4.2.2.2). Предполагается, что это мутации в структурном гене фермента. Вполне возможно, что больные являются не истинными гомозиготами, а составными гетерозиготами с двумя различными мутациями.

Обычно у больных с недостаточностью аденозиндезаминазы сильно нарушена функция В- и Т-лимфоцитов [1294], в то же время при нарушении нуклеозидфосфорилазы функция В-клеток интактна и синтез иммуноглобулинов происходит нормально. При дефекте обоих ферментов наблюдается поразительная дисфункция Т-лимфоцитов. Это проявляется в лимфопе-нии, неспособности лимфоцитов реагировать на митогены и ненормальных кожных реакциях на различные антигены.

Точный биохимический механизм, который приводит к иммунологическим нарушениям в этих случаях, не установлен. Высказывались предположения о том, что недостаточность аденозиндезаминазы обусловливает накопление дезокси-АТР, который ингибирует образование пиримидиновых дезоксирибонуклео гидов, что влечет за собой нарушение синтеза ДНК, проли-ферации лимфоцитов и, наконец, иммунного ответа. Недостаточность нуклеозидфосфорилазы может иметь сходный механизм [1294].

Наиболее эффективный метод исправления этих нарушений - пересадка костного мозга. В ряде случаев ослабления клинических симптомов, вызванных недостаточностью аденозиндезаминазы, удавалось добиться переливанием нормальных эритроцитов, которые служили источником недостающего фермента [1266].