Различия в подходах к исследованию чело-века и нейроспоры. Успехи в изучении ферментативных нарушений у бактерий и нейроспоры были достигнуты благодаря новому направлению исследований. Авторы при этом не пытались выявить био-химическую природу уже известных мута-ций, они индуцировали новые мутации и отбирали среди них те, которые затрагивали известные биохимические реакции. Такой подход дает возможность обнаружить лишь те мутации, которые действительно приводят к появлению дефектов ферментативных систем независимо от того, какую долю в общем числе мутаций они составляют.

В генетических исследованиях человека невозможно ни индуцировать новые му-тации, ни выявлять их с помощью системы отбора ауксотрофов, разработанной для нейроспоры. Поэтому изучение нарушений известных путей метаболизма совершенно бесперспективно. Приходится, отталкиваясь от изменений фенотипа, пытаться исследовать лежащие в их основе повреждения ферментных систем. Очевидный недостаток такого подхода заключается в том, что вероятность обнаружить больного с редким заболеванием сравнительно мала. Однако нет худа без добра. Ни одно экспе-риментальное животное так часто не под-вергается медицинскому обследованию, как человек, причем разнообразие методов диагностики огромно: от изучения клини-ческих проявлений, до анализа ферментов. В результате удается наблюдать широкий спектр разнообразных фенотипов. Клинические симптомы, позволяющие рас-познавать повреждения ферментов. Как об-наружить ферментативные нарушения? Са-мый простой пример отсутствие глюко-зо-6-фосфатазы при болезни Гирке. Заболевание известно уже давно, клинические проявления позволяют предполагать нарушение специфического метаболического пути. Когда эти реакции будут достаточно изучены и разработаны методы определения активности ферментов, исследователи подойдут вплотную к задаче выявления больных, у которых какой-то один из ограниченного круга ферментов, катализирующих эти реакции, является дефектным. Однако на этом пути возможны затруднения технического характера. Часто мутации обусловливают снижение сродства к субстрату. Однако в большинстве экспериментов in vitro используются настолько высокие концентрации субстрата, что даже измененный мутацией фермент обладает активностью, близкой к норме [1166]. Таким образом, эксперименты in vitro не всегда адекватно отражают активность фермента in vivo. Иногда клинические проявления могут направлять исследователей по ложному пути. Например, при болезни Помпе (гликогеноз II типа) все ферменты основного пути расщепления гликогена совершенно нормальны. Несмотря на это, гликоген накапливается в большинстве тканей, в особенности в сердечной мышце. Выяснилось, что в этом случае изменена а-1,4-глюкозидаза, которая в норме, как и другие гидролазы, находится в лизосомах (разд. 4.2.2.3) и участие которой в метаболизме гликогена не было до сих пор показано;

В других случаях симптомы настольконеопределенны, что трудно предположить, какими именно нарушениями метаболизма они вызваны. Так, например, задержки раз-вития у детей могут быть связаны с самыми разнообразными врожденными дефектами метаболизма, возникающими из-за генетически обусловленных повреждений ферментов.

Среди умственно отсталых детей, ко-торые содержатся в больницах, около 1% страдают фенилкетонурией. Впервые это патологическое состояние было обнаружено Фёллингом в 1934 г. при исследовании двух сибсов, моча которых отличалась ха-рактерным мышиным запахом и повышен-ным содержанием фенилпирувата [1080]. Это открытие навело на мысль, что и другие случаи умственной отсталости связаны с врожденными нарушениями метаболизма. Однако многочисленные исследования мочи умственно отсталых больных почти не дали результатов. Хотя и были открыты некоторые другие заболевания, например гомоцистинурия (см. ниже), в большинстве случаев умственной отсталости врожденных нарушений метаболизма, которые можно было бы обнаружить подобным способом, не было.

Заболевания соединительной ткани и костной системы, как правило, не связаны с врожденными дефектами метаболизма, од-нако есть исключения. Гомоцистинурия-4 заболевание, обусловленное нарушением метаболизма серусодержащей аминокислоты метионина вследствие недостаточности цистатионсинтазы печени. Симптомы можно объединить в три основные группы:

1) аномалии соединительной ткани и органов зрения-остеопороз, паучьи пальцы, воспаление коленных суставов, деформация хрусталика;

2) нарушения функций цент-ральной нервной системы-в 50% случаев умственная отсталость;

3) тромбозы артерий и вен. Часть перечисленных симптомов совпадает с описанными при синдроме Марфана, который наследуется доминантно, но иногда встречается как спорадический случай вследствие вновь возникающей мутации. Вот почему синдром Марфана легко может быть принят за гомоцистину-рию. Но даже отвлекаясь от этого обстоятельства, просто зная общую симптоматологию рецессивных ферментативных дефек-тов, трудно предположить, что все столь разные симптомы обусловлены дефектом одного конкретного фермента.

Клиническая диагностика нарушений мета-болизма. Болезни, вызванные наследствен-ными нарушениями метаболизма, встреча-ются довольно редко. Это значит, что даже активно работающий педиатр за все время своей практики встретится лишь с несколь-кими случаями, поэтому трудно ожидать от каждого врача постановки правильного исчерпывающего диагноза и, тем более, правильного лечения. В США и Европе существует несколько педиатрических цент-ров, специализирующихся в области диаг-ностики (в том числе пренатальной) и ле-чения отдельных заболеваний или небольших групп болезней, обусловленных на-следственными повреждениями ферментов. Такая узкая специализация позволяет обеспечить высочайший на сегодня уровень медицинского обслуживания.

Однако долг каждого врача независимо от области его специализации (будь то общая терапия, педиатрия или медицинская генетика) - правильно диагностировать заболевания, вызванные наследственными нарушениями метаболизма. Ранняя диаг-ностика важна не только в отношении бо-лезней, для которых существует специальное лечение (разд. 4.2.2.9), но и в тех случаях, когда необходимо предотвратить рождение больных детей (пренатальная диагностика).

Методы изучения ферментативных нару-шений. При изучении ферментативных нарушений пользуются методами энзимо-логии. Для выяснения генетической природы того или иного дефекта важны не только количественные изменения актив-ности фермента, но и качественные различия в характеристиках нормального и изме-ненного фермента.

Так, например, у больных детей с синдромом Леша—Найхана (30800) [1163] была обнаружена повышенная термола-бильность гипоксантин-гуанин—фосфори-бозилтрансферазы, а у детей с болезнью Фабри (сопряженной с дефектами ферментов лизосом)-необычная термостабильность 3-галактозидазы.

Часто разница между нормальным и дефектным ферментом выявляется на уровне белков, например по изменению электрофоретической подвижности. В таких случаях у измененного белка потеря или снижение каталитических свойств далеко не всегда сопровождаются изменением его иммунологических характеристик, т.е. белок сохраняет способность связываться с антителами против нормального фермента. Впервые такой перекрестно-реагирующий материал (ПРМ, англ. CRM) описан у бактерий (триптофансинтаза у Е. coli). Подобные перекрестно-реагирующие белки часто обнаруживают при наследственных нарушениях ферментов у человека (табл. 4.2): они играют важную роль в выявлении гетерозигот-носителей гемофилии А (разд. 4.2.2.8).

У человека в отличие от бактерий чаще встречаются качественные изменения фер-мента, чем случаи полной или почти полной его утраты. Это означает, что большинство известных в настоящее время фер-ментативных дефектов у человека вызвано мутациями в структурных генах, а не в регуляторных участках, как у бактерий. Эти факты весьма важны для понимания прин-ципов регуляции генов высших организмов, в том числе и у человека (разд. 4.7).

Приведенный ниже метод имеет особое значение для анализа повреждений фер-ментных систем.
Изучение ферментативных нарушений в культуре фибробластов человека. В 1940-1950 гг., когда удалось получить ответы на клю-чевые вопросы генетики бактерий, многим ученым казалось, что изучение индивидуальных клеток высших организмов позволит увеличить разрешающую способность генетического анализа эукариот на несколько порядков [162]. Условия культивирования клеточных линий были разработаны несколькими годами раньше. Однако все линии клеток, способные размно-жаться в культуре неопределенно долгое время, либо получены из злокачественных опухолей, как одна из наиболее распространенных линий-HeLa, либо при культивировании утрачивают способность к контактному торможению, т.е. «трансформируются». Генетически такие клетки отличаются от нормальных: они почти всегда анеуплоидны, причем число хромосом в наборе колеблется внутри одной клеточной ли-нии и даже внутри конкретной культуры. Трансформированные клетки непригодны для генетического анализа, необходимо разработать методы, позволяющие культивировать нормальные, эуплоидные клетки.
Количественные биохимические экспери-менты, например измерение активности ферментов, имеют смысл, только если рост клеток можно тщательно контролировать. Полезно рассмотреть принципы этих методов, поскольку они применимы и для анализа клеток из амниоти-ческой жидкости.

Возможные трудности. Метод культивирования фибробластов сопряжен с рядом трудностей. Эти клетки плохо растут или вовсе не растут на химически определенных средах. Приходится добавлять сыворотку, содержащую полный набор необходимых питательных веществ. Как правило, для этого используют эмбриональную сыворотку теленка. К сожалению, очень трудно раз и навсегда стандартизировать условия культивирования: необходимо постоянно контролировать и уточнять такие параметры, как рН, содержание глюкозы и др.
Фибробласты нельзя культивировать в жидкой среде, они растут только в виде монослоя клеток, прикрепленных к твердой поверхности. Вот почему отбирать пробы, как это делается при работе с суспензионными культурами, в данном случае нельзя. Приходится вести параллельно много культур небольшого объема. Это приводит к дополнительным вариациям, которые с трудом поддаются контролю. Следует помнить также, что для фибробластов в отличие от стабилизированных опухолевых линий число клеточных делений ограниченно и, следова-тельно, ограниченны возможности наращи-вания биомассы.

Рост фибробластов в культуре. Материал, полученный при биопсии кожи и предназначенный для хромосомного анализа, измельчают, помещают в чашки Петри с питательной средой. Чашки содержат в инкубаторе с 5%-ным С02. Это позволяет поддерживать постоянный рН. Приблизительно через 15 дней фибробласты начинают расти на поверхности среды и в конечном итоге формируют монослой. Клетки отделяют от поверхности обработкой трипсином и после центрифугирования переносят в свежую среду.

Развитие культуры происходит циклично. Цикл состоит из начальной лаг-фазы, за которой следует фаза логарифмического роста, продолжающаяся до тех пор, пока количество клеток в культуре не достигает стационарного значения («лаг-лог стационарный цикл»). В течение цикла активность ферментов и внутриклеточная концентрация метаболитов меняются. Поэтому сравнивать биохимические характеристики можно только с учетом изменений этих параметров на протяжении всех стадий цикла.

Итак, использование фибробластов человека в энзимологических экспериментах требует огромной и кропотливой технической работы [1208]. Затраченный труд, однако, как правило вознаграждается. Именно в культуре фибробластов у больного галактоземией удалось показать нарушение функций галактозо-1 -фосфат—уридилтрансферазы [1177]. Благодаря этому методу были обнаружены многие нарушения функций ферментов. Он лежит и в основе пренатальной диагностики, которая в настоящее. время с успехом используется для изучения генетически обусловленных повреждений ферментов.

Однако не все повреждения ферментов проявляются в фибробластах. В таких случаях можно использовать для анализа линии других клеток, например линии лимфоцитов или эритроцитов. Заметим, что, как правило, повреждения ферментов, не поддающиеся исследованию в фибробластах, нельзя изучать и в культуре клеток из амниотической жидкости.