Молекулы гемоглобина. Молекула челове-ческого гемоглобина состоит из четырех полипептидных цепей. Молекула гемогло-бина обозначается общей формулой а2$2, которая показывает, что в состав молекулы входят две пары сходных цепей глобина [1348]. Большинство разновидностей гемо-глобина человека имеют идентичные а-це-пи и различаются по другим цепям. К каждой цепи глобина в специфическом участке присоединяется молекула небелко-вой природы -гемогруппа, или гем (рис. 4.34). Четыре глобиновые цепи, каждая со своим гемом, образуют функциональную молекулу гемоглобина, которая переносит кислород из легких в ткани. Молекула гло-бина построена из 140 с небольшим амино-кислот, которые расположены в строго определенном порядке (рис. 4.35). Последо-вательность аминокислот в белке (например, в гемоглобине) считают его первичной структурой. Пространственное расположе-ние соседних остатков называется вторич-ной структурой, а трехмерное расположение белковых субъединиц-третичной структурой (рис. 4.34). Термин четвертичная структура относится к взаимной организации четырех субъединиц в составе функционирующей молекулы.

Преобладающим типом гемоглобина у детей и взрослых является НЬА, или гемо-глобин взрослых (сс2р2). Его отличительная черта строение р-цепи (рис. 4.35). а- и Р-цепи различаются по многим аминокис-лотным остаткам. У всех взрослых есть небольшое количество (2-3%) гемоглобина НЬА2(сс252). Характерная для него 5-цепь отличается от р-цепи только по десяти ами-нокислотным остаткам. После рождения у всех детей обнаруживается также небольшое количество (меньше 1%) фетального гемоглобина HbF:a2y2 (см. ниже), у-цепь значительно отличается от а- и (3-цепей. a-цепи НЬА, НЬА2 и HbF идентичны.

Существует несколько типов гемоглоби-нов, характерных для эмбрионального и фетального развития. С,-цепи напоминают по аминокислотному составу а-цепи [1155], а Е-цепи похожи на р-цепи [1232]. С,-цепи, вероятно, появляются раньше других в эмбриональном развитии. ^- и ?-цепи исчезают через 8 10 недель внутриутробного развития (рис. 4.36) [1364]. Затем преобла-дающим становится гемоглобин HbF(a2y2), который отличается от других присутствием у-цепи. Известно два типа у-цепей: с аланином (Ау) или с глицином (Gy) в 136-м положении. Существует и третий тип у-цепи с треонином вместо изолейцина в 75-м положении [1281; 1319]. Он встречается у 10-15% эмбрионов и, судя по всему, не связан с каким-либо нарушением. Гемоглобин а2(32 обнаруживается уже на 6-8 неделе развития плода [1319; 1364].

Синтез у-цепей у эмбриона происходит в основном в печени и селезенке, но могут они синтезироваться и кроветворными клетками костного мозга. Наоборот, Р-цепи, в детстве и в более зрелом возрасте синтезируются главным образом в костном мозге, однако синтез вне костного мозга также возможен [1364]. Различные типы гемоглобина перечислены в табл. 4.12.
Все нормальные гемоглобины человека, которые были исследованы, имеют иден-тичную трехмерную структуру (рис. 4.34), существенную для переноса кислорода. Все

глобиновые цепи различных гемоглобинов имеют общее эволюционное происхождение и возникли в результате последовательных дупликаций генов (см. разд. 7.2.3). Чем больше сходство между двумя цепями, тем позднее в эволюции произошла дупликация. Очевидно, цепи Ау и Gy, которые различаются по одной аминокислоте, диверги-ровали позже всех других, а дупликация генов {3- и a-цепей произошла в весьма отдаленном прошлом.

Гены гемоглобина. Аминокислотная после-довательность каждой глобиновой цепи ко-дируется своим собственным геном. В гаплоидном наборе у нормального человека присутствует по крайней мере по одному гену а, р, у, 5, г, С, и по крайней мере по два таких гена-в диплоидном наборе. В боль-шинстве популяций человека ген а-цепи существует в дуплицированном состоянии, причем отличий между двумя a-генами не обнаружено [1350]. Имеются два гена у-це-пей Ау и Gy, которые различаются по кодо-ну, детерминирующему аминокислотный остаток в 136-м положении. Некоторые гены Ау несут необычный кодон, в результате в 75-м положении изолейцин замещен на треонин (ТАу).

Синтез небелковой гемогруппы также контролируется генами, поскольку они ко-дируют ферменты, обеспечивающие био-синтез тема.
Различные гены глобинов, соответст-вующие им глобиновые цепи и различные нормальные гемоглобины приведены в табл. 4.12 и на рис. 4.37.
Была подробно исследована структура всех генов глобинов, опубликованы их пол-ные нуклеотидные последовательности [981; 1041; 1200; 1273; 1304; 1314]. Подобно многим генам млекопитающих, гены глобинов у человека образуют мультигенное семейство и расположены на хромосомах в составе двух кластеров (рис. 4.38, 4.39). a-кластер глобиновых генов занимает 25000 пар оснований (25 т. п. н.) в коротком плече 16-й хромосомы. Семейство у-Р-5-ге-нов глобина расположено в коротком плече 11-й хромосомы на участке длиной 60 т. п. н. Пока остается неизвестным генетический механизм, регулирующий координированное функционирование генов на двух различных хромосомах, в результате которого образуется равное количество субъединиц а- и Р-у-типа. В a-кластере структурные гены расположены в следующем порядке в направлении от 5 к 3: ген эмбриональной ?-цепи, псевдоген ^-цепи, псевдоген а-цепи и два идентичных гена а-цепи (рис. 4.38). Выяснено расположение генов и в (3-кластере: ген эмбриональной s-цепи, два гена фетальных у-цепей (Ау и Gy), псевдоген |3-цепи, ген 5-цепи и ген Р-цепи (рис. 4.39). Порядок расположения генов в этих кластерах совпадает с очеред-ностью их экспрессии в онтогенезе. По последовательности нуклеотидов псевдогены мало отличаются от своих функциональных гомологов. Однако в результате различных мутаций стала невозможной их транскрипция и, следовательно, экспрессия. Предполагается, что псевдогены возникли в результате дупликации, после которой их экспрессия перестала быть необходимой для нормального функционирования орга-низма. Ген 5-глобина, продукт которого составляет лишь 2-3% всего гемоглобина, можно считать геном, который находится в переходном состоянии к псевдогену.

Все глобиновые гены во многом сходны по своей функциональной организации. Каждый из них имеет в составе три коди-рующие последовательности, т.е. три экзо-на. Между 1-ми 2-м экзонами и между 2-м и 3-м экзонами расположены уникальные
вставочные последовательности, или интроны, известные соответственно как IVS-1 и IVS-2 (от англ. intervening sequences) (рис. 4.38, 4.39, 4.40). Интроны транскрибируются вместе с экзонами, так что в первичном транскрипте представлены как кодирующие, так и некодирующие последовательности соответствующего гена. Вставочные последовательности вырезаются в ходе процессинга, который происходит в ядре, в результате конец первого экзона соединяется с экзоном 2, а конец второго экзона-с экзоном 3, при этом образуется функциональная мРНК, которая и служит матрицей для синтеза гемоглобина на рибосомах (рис. 4.40). Две вставочные последовательности идентичны у различных генов у-5-р*-кластера, но отличаются от более коротких интронов генов а-кластера. Детали процесса сплайсинга пока не ясны, однако для его изучения оказались весьма полезными мутации, которые вызывают [3-та-лассемии (см. ниже) и обусловлены нарушениями вырезания интронов. Все интроны начинаются с нуклеотидов GT (донорный сайт) и кончаются динуклеотидом AG (ак-цепторный сайт)-эти динуклеотиды состав-ляют часть так называемых обобщенных последовательностей сайтов сплайсинга. Более подробно см. в [1041 и 1238]. Некоторые детали этапов синтеза гемоглобина (от гена до белковой молекулы) представлены на рис. 4.40 и 4.41.

Генетические доказательства несцеплен-ности генов а- и Р-глобинов появились задолго до определения структуры кластеров этих генов. Было показано, что если один из родителей является двойной гете-розиготой с мутациями в генах а- и Р-гло-бинов, а другой - нормальной в отношении гемоглобина гомозиготой, то в потомстве выявляются четыре фенотипа: нормальный, с измененным а-глобином, с измененным Р-глобином и двойной мутант (рис. 4.42) [1014]. Если бы гены а- и р-глобинов были тесно сцеплены, то в потомстве наблюдались бы генотипы Hbax и НЬ6Х, но не было бы двойных мутантов или нормальных ин-дивидов. Подобным образом генетически доказано тесное сцепление генов 5- и Р-гло-бинов: если один из родителей был двойной 1 с1срозиготои с мутациями в генах р- и 5-цепей, то рекомбинантов среди детей не было [1013] (рис. 4.43). Открытие гемо-глобина Lepore-продукта слияния генов 5-и Р-цепей - послужило биохимическим до-казательством сцепления этих генов в сос-таве одной хромосомы [1350] (см. ниже). Вывод о сцеплении генов у- и Р-глобинов был сделан на основании исследований ге-моглобина Kenya, ген которого образуется при слиянии этих двух генов.

Промоторы. Перед каждым глобиновым геном расположены три различные после-довательности. Они близки по структуре у разных генов и, судя по всему, участвуют в регуляции транскрипции (рис. 4.40). Их на-зывают промоторными элементами [1041; 1238]. В их число входит TATA или АТА-блок (последовательность Хогнесса), кото-рый находится на расстоянии в 30 пар нуклеотидов от точки начала транскрипции. Эта последовательность представляет собой элемент промотора, необходимый для точной инициации транскрипции. Другая последовательность, СААТ, расположенная 5а oU пар основании от стартовой точки, служит сайтом узнавания для РНК-полимеразы. Третий, дистальный, элемент локализован за 80-100 нуклеотидов, имеет характерную последовательность PuCPuCCC (Pu-пурин). До сих пор неизвестно, требуются ли для образования глобинов «энхан-серы» (усилители)-генетические элементы, влияющие на эффективность транскрипции независимо от их позиции или ориентации.

Последовательности, расположенные за ге-ном. Терминация транскрипции осуществ-ляется примерно через 1000 пар оснований после 3-го экзона гена р-глобина (рис. 4.40). Сигналом расщепления РНК эндонуклеа-зой служит последовательность AAUAA, к которой затем присоединяется polyA-«хвост» длиной в 220 нуклеотидов. Она незакодирована в ДНК и необходима для стабилизации мРНК, которая переносит ге-нетическую информацию от ядерных генов к рибосомам, где в результате соединения аминокислот в нужной последовательности происходит синтез глобинов (рис. 4.41).

Полиморфизм ДНК в области глобиновых генов. [972; 1253]. При картировании генов у-8-р-кластера с помощью рестрикционно-го анализа была обнаружена значительная вариабельность последовательности ДНК у различных индивидов (рис. 4.40). Все известные варианты Р-глобинового комп-лекса генов возникли в результате одиночных нуклеотидных замен и обозначаются как присутствующие ( + ) или отсутствующие ( —). Среди 17 полиморфных сайтов в (3-кластере 12 локализованы во фланкирую-щих последовательностях, 3 внутри нитро-нов, 1 внутри псевдогена и только 1 внутри кодирующей части гена (3-глобина (сино-нимическая замена). Такое расположение закономерно, поскольку мутации в коди-рующих областях скорее могут вызвать нежелательные эффекты. Большая часть ДНК, расположенной между структурными генами, не экспрессируется, поэтому изменения нуклеотидной последовательности в этих районах обычно не имеют функциональных последствий. Различные полиморфные сайты имеют древнее происхождение, поскольку они обнаружены у всех расовых групп (табл. 4.13). Заметим, однако, что некоторые варианты встречаются только у негров, у других расовых групп их нет.

Два случая полиморфизма ДНК в се-глобиновом локусе относятся к гиперва-риабельным районам, состоящим из раз-личного числа случайно повторенных фраг-ментов ДНК длиной 36 нуклеотидов (разд. 2.3.3.9).