Выявление гетерозигот по ФКУ и гиперфе-нилаланинемии. Для заболеваний, связанных с нарушением метаболизма (в частности, ФКУ), выявление гетерозигот имеет не только теоретическое, но и практическое значение, поскольку может быть использовано для генетических рекомендаций близким родственникам, например сибсам, родители которых страдали ФКУ. Сибсы, не имеющие признаков заболевания, с вероятностью 2/3 являются гетерозиготами. Идеальный метод выявления гетерозигот -прямой анализ фермента, для которого в настоящее время необходима биопсия печени. Другие методы основаны на целенаправленной перегрузке этого метаболического пути: даже имеющейся у гетерозиготы активности фермента достаточно для пе-реработки фенилаланина, в норме потреб-ляемого с пищей, ее может не хватить для переработки избытка фенилаланина. Пер-вую попытку тестирования гетерозигот с помощью избытка фенилаланина пред-принял в 1967 г. Хсиа [1134]; он вводил фенилаланин гетерозиготам и следил за его исчезновением в крови. Оказалось, что ге-терозиготы довольно четко отличаются от нормальных индивидов. Позднее этот ме-тод удалось усовершенствовать, измеряя в крови не только уровень фенилаланина, но и тирозина, который, как установлено, у гетерозигот несколько ниже.

Состояние здоровья у гетерозигот. На первый взгляд гетерозиготные родители больных ФКУ, а также их братья и сестры абсолютно здоровы. Пенроуз [1262], од-нако, обнаружил в семье больных ФКУ у шести родственников особый вид психи-ческого заболевания депрессивного типа, которое проявлялось после 50 лет. Он предположил, что для гетерозигот харак-терен повышенный риск заболевания пси-хическими расстройствами. Однако в тече-ние последних 50 лет проблеме возможных аномалий и подверженности заболеваниям у гетерозигот по ФКУ уделялось поразительно мало внимания, и немногие исследования, посвященные этой проблеме, часто не адекватны с точки зрения эпиде-миологии. Этот вопрос рассматривается в недавнем обзоре [1340].

Особенности, выявляемые у гетерозигот по ФКУ, подразделяются на 4 основных типа: отклонения по IQ и другим психоло-гическим тестам; повышенный риск психи-ческих заболеваний; отклонения от нормы в электроэнцефалограмме (ЭЭГ), нарушение процессов размножения. Первые три аспекта будут подробно рассмотрены в разд. 8.2.3.2, посвященном генетике поведения; здесь отметим лишь, что большинство гетерозигот психически здоровы, однако для них высок риск заболеть шизофренией определенного типа, развивающейся в позднем возрасте. Описано небольшое снижение IQ (особенно в отношении устной речи), довольно часто выявляются отклонения в ЭЭГ. Согласно некоторым данным (вызывающим сомнение), для гетерозиготных по ФКУ женщин повышен риск спонтанных абортов и мертворождений.

Заслуживают внимания отдельные сооб-щения об аномально высоком уровне фени-лаланина крови у гетерозигот в стрессовых ситуациях, таких как грипп с высокой температурой [1008] или беременность. Специалистами в области экогенетики было выдвинуто интересное предположение, что аспартам, подслащивающее вещество с высоким содержанием фенилаланина, может наносить вред развивающимся эмбрионам у гетерозиготных женщин. (См. обсуждение материнской гиперфенилаланинемии в разд. 9.1.) Приведенные здесь данные, касающиеся гетерозигот по ФКУ, пока нельзя считать доказанными. Обследование нескольких сотен детей с небольшим умственным отставанием и отклонениями в поведении показало наличие среди них индивидов с повышенным уровнем фенилаланина в крови [1125]. Для проверки этих данных необходимы дополнительные исследования. Если факты подтвердятся, можно будет с уверенностью сказать, что уменьшенная активность фермента у гетерозигот делает их более подверженными определенным стрессовым ситуациям: этот феномен необходимо изучать.

Общие проблемы выявления гетерозигот. Впервые важность выявления и изучения гетерозигот для медицинской генетики отметил в 1949 г. Нил [1236]. Им были систематизированы имевшиеся в то время разрозненные данные. Позже (в 1953 г.) появились более полные работы Нила [1237] и (в 1954 г.) Франческетти и Клайна [1084]. Быстрое развитие биохимической генетики сделало возможным выявление гетерозиготных носителей многих болезней, особенно тех, которые обусловлены дефектами ферментов, выявляемых в фиб-робластах или клетках крови (табл. 4.10). Как правило, активность ферментов у гетерозигот снижена приблизительно вдвое по сравнению с нормальными гомозиготами, однако во многих случаях четкую грань между этими двумя группами провести невозможно. Некоторые индивиды демонстрируют промежуточные характе-ристики даже при прямом измерении активности фермента. Это неудивительно, если принять во внимание, что разные мутации в составе одного и того же локуса вызывают изменения активности фермента различных типов. Выявление гетерозигот важно не только для изучения механизма действия ферментов, оно имеет очень боль-шое практическое значение. Установление факта гетерозиготности очень существенно для людей, у которых близкие родственники страдают болезнями, детерминируемыми Х-хромосомой или аутосомно-рецес-сивными болезнями. Например, сыновья женщин, гетерозиготных по Х-сцепленному заболеванию, с вероятностью 50% наследуют эту болезнь. Для большинства ауто-сомно-рецессивных болезней выявление гетерозигот не играет столь важной роли, если только потенциальные гетерозиготы-братья или сестры больного гомозиготного индивида-не собираются жениться на двоюродных родственниках. Риск появления гомозиготных детей имеется только в том случае, когда будущие родители оба гетерозиготны, а для большинства рецес-сивных заболеваний вероятность случайной встречи таких гетерозигот чрезвычайно мала (см. закон Харди - Вайнберга, разд. 3.2). Выявление гетерозигот - необходимый этап при обследовании популяций. Установлено, например, что около 8% негри-тянского населения Америки-гетерозиготны по гену серповидноклеточной анемии и около 3-4% евреев-ашкенази являются гетерозиготами по гену болезни Тея-Сакса. Наиболее распространенным (1:2000) рецессивным заболеванием в Северной и Центральной Европе следует считать муко-висцидоз. Гетерозиготы по нему состав-ляют 4-5% всей популяции. Их выявление в этом случае очень желательно, поскольку велика вероятность обнаружения пар, в которых оба партнера несут ген муковисци-доза в гетерозиготном состоянии (не зная об этом). Потомство таких пар необходимо подвергать внутриутробному обследованию. К сожалению, основной биохимический дефект при этом заболевании неизвестен. Поиск гетерозигот и пренатальная диагностика значительно упростились после того, как ген, ответственный за это заболевание, с помощью тесно сцепленного маркерного фрагмента ДНК был локализован в 7-й хромосоме [1167; 1344а; 1357а].

Подверженность заболеваниям у гетерозигот по рецессивным состояниям. Отсутствие простого надежного способа выявления гетерозигот по муковисцидозу достойно сожаления еще и потому, что с его помощью можно было бы решить и другую серьезную проблему. В начале 60-х годов появилось сообщение, согласно которому гетерозиготные носители муковисцидоза имеют повышенный риск заболеть язвой желудка или двенадцатиперстной кишки, а также хроническим бронхитом [1170]. Последующие исследования как будто не подтвердили эти данные. Окончательно вопрос можно будет решить только после того, как в возрастной группе, особенно подверженной названным заболеваниям, будут учтены все гетерозиготы. Подобные исследования возможны только при наличии надежного теста на гетерозиготность. В разд. 3.7.4 обсуждалась недостаточность а 1 -антитрипсина как пример гомозиготного состояния, которое во многих случаях обусловливает подверженность хроническим обструктивным болезням легких. Опасность заболеть увеличивается при соприкосновении с определенными агентами окружающей среды, такими как табачный дым. Известно также, что гетерози-готы по серповидноклеточной анемии здоровы в нормальных условиях, но при умеренной гипоксии, например на высоте свыше 2500 м над уровнем моря, у них может возникнуть серповидноклеточная анемия и развиться инфаркт селезенки.

Имеется много разрозненных данных [2340], касающихся других заболеваний. Например, у гетерозигот по различным липидозам наблюдается незначительное снижение IQ в сочетании с личностными расстройствами. У гетерозигот по цистинурии часто образуются камни в почках; гетерозиготы по галактокиназной недостаточности подвержены преждевременной катаракте; при некоторых разновидностях болезни Вильсона описаны нарушения функционирования почечных канальцев и незначительные неврологические изменения. Возможный риск развития рака был тщательно изучен для гетерозигот по пигментной ксеродерме, которая обусловлена нарушением эксцизионной репарации ДНК (разд. 5.1 6.3). Повышенный риск рака в сравнительно молодом возрасте был характе-рен для синдрома Блума и для атаксии-теле-ангиэктазии (но не для анемии Фанкони). Интересно отметить, что вероятность заболеть раком кожи для гетерозигот по пигментной ксеродерме повышена только на юге США, но не в других районах страны В данном случае налицо экогенетическая проблема: увеличение интенсивности УФ-излучения вызывает перегрузку эксцизионной системы репарации, которая вполне может справиться с низким уровнем УФ-излучения.

Для того чтобы сделать обоснованный вывод о подверженности обычным болезням и о наличии небольших физиологических отклонений, требуются сложные ста-тистические исследования и тщательный подбор контролей. Прежде всего необходимо обследовать большое количество гетерозигот, выявленных надежными биохимическими и генетическими методами. Изучение гетерозигот позволит глубже понять генетические условия, вызывающие обычные заболевания, и подойти к решению многих других проблем. Например, вариабельность, выявляемая при измерении IQ, в значительной степени может быть вызвана в популяции просто высокой частотой гетерозигот по рецессивным болезням (см. разд. 8.2.3.2). Если окажется, что повышенная чувствительность к заболеванию у гетерозигот является правилом, а не исключением, наши предсказания об увеличении мутационного груза, обусловленного ионизирующей радиацией и химическими мутагенами, придется в значительной степени пересмотреть. Таким образом, необходимы дальнейшие исследования в этом направлении. Особенно важно разрабатывать качественные тесты, позволяющие отличать гетерозигот от нормальных индивидов.

Тестирование гетерозигот при гемофилии А(30670). Особое значение в генетической консультации имеет выявление гетерози-готных носителей в случае заболеваний, сцепленных с полом. Гемофилия А-одно из наиболее часто встречающихся заболеваний, детерминируемых Х-хромосомой (разд. 3.1.4). Она возникает в результате нарушения гуморального фактора, необходимого для первой стадии свертывания крови (рис. 4.27)-антигемофилического глобулина (фактор VIII). У нормальных индивидов активность этого белка в плазме варьирует от 40 до 300% относительно среднего значения в популяции, принятого за 100% [1277]. У больных гемофилией активность фактора VIII резко снижена или даже полностью отсутствует. Однако плазма большинства больных содержит вещество, которое реагирует с антисывороткой к фактору VIII. Судя по всему, в крови таких гемофиликов содержится антигемо-филический глобулин, потерявший свою активность, но сохранивший иммунологические свойства в качестве перекрестно-реагирующего материала (ПРМ, англ. CRM разд. 4.2.2.2); концентрация такого белка-нормальная. У гетерозигот благодаря инактивации Х-хромосомы половина клеток продуцирует активный фактор VIII, способный обеспечить свертывание крови и проявлять специфические иммунологические свойства. Остальные клетки продуцируют ПРМ, сохраняющий иммунологические свойства, но утративший способность участвовать в свертывании крови. Таким образом, активность свертывания крови у гетерозигот должна быть снижена прибли-зительно вдвое по сравнению с нормой. При иммунологическом определении, однако, будет выявляться нормальное количество антигемофилического глобулина, поскольку с антителами будут одновременно реагировать и активный белок, и ПРМ.

До разработки иммунологического теста идентификация гетерозигот основывалась только на определении активности фактора VIII. Хотя средняя активность у гетерозигот действительно была низкой и составляла около 50%, сохранялось большое перекрывание между гетерозшотами и нормальными индивидами, сильно затруд-нявшее генетическую консультацию. Этот результат не удивителен, поскольку у здо-ровых людей способность к свертыванию крови варьирует в огромной степени. Серьезный прогресс стал возможен после введения в практику количественного им-мунологического теста. Однако, прежде чем использовать этот метод, необходимо доказать наличие ПРМ в крови хотя бы одного больного гемофилией в обследуемой семье, поскольку существует разновидность гемофилии А (острая), при которой ПРМ в крови отсутствует. A priori ясно, что не всякую гетерозиготную женщину можно выявить таким способом, поскольку вследствие случайной инактивации Х-хро-мосомы некоторые индивиды будут абсолютно нормальными по обоим тестам (иммунологическому и свертываемости). Совсем недавно для идентификации носите-лей гена гемофилии стали применяться усовершенствованные биохимические ме-тоды, в особенности определение компо-нентов молекулы фактора VIII; кроме того, стали более адекватными статистические методы, объединившие вероятностные оценки на основе изучения родословных и результаты лабораторных исследований [ 1111 а, б]. Обнаружение полиморфизма ДНК в гене фактора VIII открыло новые перспективы не только для выявления гетерозигот, но и для пренатальной диаг-ностики.

Здесь будет уместно заметить, что последние годы характеризовались впечатляющим прогрессом в исследованиях свертывания крови и его нарушений. Совместная работа различных белков, подчиненных сложному генетическому контролю, в процессе свертывания крови и растворения тромбов это пример взаимодействия многих генетических факторов в выполнении сложной физиологической функции. Этот клубок удалось распутать в основном благодаря изучению крови больных с различными генетическими нарушениями свертываемости. Свертывание крови-это не простая и даже не просто разветвленная цепная реакция; в нее входят циклы обратной связи. Некоторое представление о системе свертывания крови дает рис. 4.27. Эта тема детально обсуждается в литературе [1111а, б; 1214].

Выявление гетерозигот по мышечной дист-рофии Дюшенна [1119; 1221]. Определение носителей дефектного гена особенно важно с практической точки зрения при Х-сцеп-ленной мышечной дистрофии Дюшенна (31020). Это тяжелое неизлечимое заболевание, которое неизбежно ведет к ранней смерти. Вот почему у женщин с высоким риском рождения больного мальчика беременность разумнее прекратить, если установлено, что эмбрион мужского пола. Из этого следует, что риск рождения больного и статус носителя должны быть определены с максимальной точностью. Для этого необходимо сочетание статистических и биологических методов (см. приложение 8). Среди биологических методов наиболее информативен метод измерения активности сывороточного фермента - кре-атинфосфокиназы. В норме этот фермент обнаруживается только в мышцах, и уровень его в сыворотке низок. Однако при нарушении мышечной ткани большое ко-личество фермента попадает в кровь и активность его возрастает. У гемизиготных больных мужчин регистрируется очень высокий уровень креатинфосфокиназы. Лишь на последних стадиях болезни, когда разрушена уже большая часть мышечной ткани, он снижается. Около 70% женщин, достоверно являющихся гетерозиготными носителями (у которых по крайней мере один сын пораженный), имеют отчетливо повышенный уровень фермента в крови. Проблема диагностики осложняется тем обстоятельством, что нормальные индивиды и носители наиболее четко различаются лишь в детстве, а с возрастом уровень креатинкиназы падает и у здоровых, и в еще большей степени у гетерозигот. Падает он также и в ходе беременности.

Помимо определения активности креа-тинкиназы было предложено много других способов выявления гетерозигот. Недавно с помощью методов ультрасонографии или компьютерного ультразвукового сканиро-вания у носителей обнаружены значитель-ные изменения в строении бедренных и икроножных мышц [1283]. В будущем значительную роль в более точной оценке риска, несомненно, будет играть анализ сцепления с ДНК-маркерами на основе технологии рекомбинантных ДНК [1358] (разд. 3.4.3). Заметим, однако, что дистрофия Дюшенна нередко проявляется в семье спорадически, т. е. возникает вследствие новых мутаций в половых клетках матери (разд. 5.1.3.4), что во многих случаях зат-рудняет анализ сцепления. Вот почему совершенно необходимо улучшать методы выявления носителей по их фенотипу. Мозео [1221] и Харпер [1119] выдвинули ряд полезных предположений для генетической консультации.

Трудности в выявлении гетерозигот. Если о гетерозиготности судят по уровню фермен-тативной активности или на основании какого-либо количественного анализа крови, часто возникают осложнения, связанные с перекрыванием значений. Методы поиска гетерозигот могут заметно различаться для носителей аутосомно-рецессив-ных или сцепленных с Х-хромосомой мутаций, с одной стороны, и для носителей гена аутосомно-доминантного заболевания, с другой. В большинстве случаев средние уровни анализируемого вещества у гетеро-зигот и у нормальных индивидов достоверно различаются. Однако при этом, как правило, имеет место значительное перекрывание выборочных распределений, так что многие здоровые люди по уровню анализируемого вещества могут быть ошибочно приняты за гетерозигот. Причины этого явления не вполне ясны, возможно, оно связано с существованием невыявлен-ных «изоаллелей», каждый из которых определяет свой диапазон уровней ферментативной активности (разд. 3.6). При использовании количественных тестов для правильной интерпретации результатов важно оценить априорную (или байесовскую) вероятность гетерозиготности.

В таблице 4.11, Л в качестве примера показаны результаты ферментного анализа для острой перемежающейся порфирии. Это заболевание может проявляться у гетерозигот, но при скрининге популяции большую часть случаев повышения активности порфобилиноген-дезаминазы следует отнести к ложным гетерозиготам, поскольку реальная популяционная частота истинных гетерозигот составляет всего лишь 1:10000. Для больного, среди родственников которого нет пораженных порфи-рией, но у которого некоторые клинические симптомы позволяют заподозрить это заболевание, априорную вероятность можно оценить только грубо. У брата или сестры достоверно больного априорная вероятность гетерозиготности составляет 50%. Вероятность того, что в таких случаях результаты обследования действительно свидетельствуют в пользу гетерозиготности, можно вычислить, исходя из априорного ожидания и степени перекрывания между здоровыми и гетерозиготами, которая должна быть определена по возможности точно (табл. 4.11, Л, Б).

Из этого вытекает необходимость орга-низации централизованных лабораторий, где должно проводиться сравнительное обследование большого числа здоровых и гетерозигот и где можно было бы получить генетическую консультацию.

Изучение уровня порфобилиноген-деза-миназы при острой перемежающейсяпор-фирии показало, что значения активности этого фермента, характерные для 30% контрольной (т. е. нормальной) популяции, перекрываются со значениями, полученными на выборке несомненных гетерозигот, страдающих острой перемежающейся пор-фирией (1) (табл. 4.11). Только у 20% ге-терозигот уровень фермента был ниже, чем у всех представителей контрольной популяции. Рассмотрим модельный случай, когда у людей различных групп установлена одна и та же активность фермента 95 единиц (табл. 4.11). В соответствии с априорными оценками вероятности (табл. 4.11, А) общая оценка вероятности носительства гена порфирии составит: а) 0,07% для человека из общей популяции без каких-либо симптомов; б) 7% для человека с 1%-ным риском; в) 44% для лиц с 10%-ным априорным риском и г) 87% для близкого родственника больного с 50%-ным риском. Эти данные показывают значительную неопределенность диагноза в том случае, когда не может быть получена надежная априорная оценка вероятности заболевания. Надо отметить, что повторные измерения не всегда делают окончательную оценку более точной. При очень низких и очень высоких уровнях фермента интерпретация отличается, если, как в нашем примере, для большого числа нормальных и гетерозиготных особей известны уровни активности фермента.

В отличие от количественных оценок, которые, как правило, неоднозначны, ка-чественная аномалия по закону «все или ничего», выявленная биохимически или с помощью рекомбинантных ДНК, позволяет поставить четкий диагноз независимо от априорных вероятностных оценок.